QIAGEN 质粒纯化试剂盒 使用说明书
1、 从生长良好的选择性培养基中挑取一个单个菌落，接种到一个含有适当抗生素的 2~5mlLB 培养基中培养。
37℃快速摇动培养（~300rpm）8 小时。
用一个管或瓶装最少 4 次培养的量。
2、 用 LB 选择培养基将培养物从 1/500 稀释到 1/1000。给高复制的质粒接种 25ml 或 100ml 培养基。给低复制
的质粒接种 100ml 或 500ml 培养基。37℃快速摇动培养（~300rpm）12~16 小时。
用一个瓶或容器装最少 4 次培养的量。培养物必须达到大约 3~4×109
/ml 的细胞密度，
3、 在 4℃6000×g 离心 15 分钟收集细菌细胞。
在 Sorvall GSA 或 GS3 或 Beckman JA-10 离心机上 6000×g 相当于 6000rpm 离心。倾去离心管中所有上清至培
养基全部控干。
如果想停止实验并过些时间继续的话，将细胞冻存在-20℃中。
4、 在 4ml 或 10ml Buffer P1 中重悬浮细菌细胞沉淀。
为了保证有效的消散应采用足够大的容器使能够充分混匀消散缓冲剂，要保证缓冲剂 P1 中加有 Rnase A。应
当充分振荡混匀直至没有可见的细菌团块。
5、 加入 4ml 或 10ml Buffer P2，颠倒 4-6 次轻柔混匀，室温放置 5 分钟。
不要漩涡混匀，否则会导致 DNA 断链。溶液将具有粘性。混匀时间不要超过 5 分钟。使用后应将含有 Buffer
P2 的瓶子立刻盖紧以避免被空气中的二氧化碳酸化。
6、 加入 4ml 或 10ml 预冷 Buffer P3，颠倒 4-6 次轻柔混匀，并且在冰上放置 15-20 分钟。
使用预冷的 Buffer P3 和放置在冰浴中可以增多沉淀量。在加入 Buffer P3 以后，一种白色絮状物形成并且溶
液粘性下降。沉淀物中包含有染色体 DNA、蛋白质、细胞碎片和 SDS。应将溶液充分混匀消除局部十二烷基硫
酸钾沉淀。
7、 在 4℃≥20000×g 离心 30 分钟。快速吸取含有质粒 DNA 的上清部分。
在离心之前，样品要再次混匀。应使用不是玻璃的离心管离心（例如：聚丙烯）。20000×g 的离心力相当于
Beckman JA-17 转子的 12000×rpm 或 Sorvall SS-34 转子的 13000×rpm。离心后上清部分为清澈透明的。
注释：使用 QIAfilter Midi 或 Maxi Catridge 过滤代替离心步骤 7 和步骤 8，溶解产物将被有效的清除。
8、 将上清部分在 4℃≥20000×g 再离心 15 分钟。快速吸取含有质粒 DNA 的上清部分。
次离心是为了 避免悬浮或者微小的物质进入 QIAGEN-tip。悬浮物（引起样品发生混浊）能够阻碍
QIAGEN-tip 并且减小或消除在重力作用下流动。
从清澈的液体上清上吸出 240μ l 或 120μ l 样品并且除了凝胶分析外（样品 1）还为了确定是否生长和稀释条
件是否 。
9、 用 4ml 或 10ml Buffer QBT 平衡 QIAGEN-tip 100 或 QIAGEN-tip 500，使柱形透析在重力作用下流空。
缓冲液的流动将在由于平衡缓冲液中去污剂的存在使表面张力减小的作用下自动进行。使 QIAGEN-tip 完全流
干。自缓冲液流动停止后，当凹液面到达玻璃柱上面 QIAGEN-tip 能被自动的分离。
10、将步骤 8 中的上清液加入 QIAGEN-tip 并且在重力作用下使其进入树脂。
上清液将被迅速的在 QIAGEN-tip 上装满。如果它离开时间过长或变混浊是用于蛋白质的快速形成。必须在装
进 QIAGEN-tip 前离心或过滤以防堵塞。
在流过的液体中吸出 240μ l 或 120μ l 样品除了凝胶分析外（样品 2）还为了确定通过 QIAGEN 树脂的 DNA 聚合
物的功效。
11、用 2×10ml 或 2×30ml Buffer QC 冲洗 QIAGEN-tip。
将缓冲液 QC 在重力的作用下穿过 QIAGEN-tip。 次冲洗是充分的去除掉大部分质粒 DNA 制备中的污染物。
次冲洗在大量培养量或细菌过渡生长大量糖类被使用时显著重要。
从复合清洗的部分中吸出 400μ l 或 240μ l 样品并且做凝胶分析（样品 3）。
12、用 5ml 或 15ml Buffer QF 洗提 DNA。
将过滤后的液体或收集到一个 10ml 或 30ml 的试管中。聚碳酸酯离心管不推荐使用因为聚碳酸酯在后面的步骤
中对乙醇并不稳定。
从过滤液中吸出 100ml 或 60ml 样品并且做凝胶分析（样品 4）
如果你想停止实验并且晚些继续，经过滤液放置在 4℃。储存周期 不要超过一夜。
13、沉淀 DNA 中加入 3.5ml 或 10.5ml(0.7 倍体积)室温异丙醇洗涤 DNA。混匀并且在 4℃≥15000×g 离心
30 分钟。小心吸取上清。
所有的溶液室温保存为了减少盐类沉淀，离心在 4℃进行是为了防止样品过热。15000×g 的离心力相当于在
Beckman JS-13 离心转子 9500rpm 或 Sorvall SS-34 离心转子 11000rpm。二选其一，在 4℃5000×g60 分钟离
心中使用锥形底部的离心管。异丙醇颗粒外表透明并且也许会模糊的更加难看到。含有盐类的小球由于乙醇的
沉淀作用而产生。离心前在离心管外做标记会更容易找到颗粒。异丙醇颗粒同样松散的在离心管中，在吸出上
清是要小心。
14、用 2ml 或 5ml 室温 70%乙醇洗涤 DNA 沉淀，并且在 4℃≥15000×g 离心 10 分钟。小心弃去上清不要打
乱沉淀。
二选其一，在 4℃5000×g60 分钟离心中使用锥形底部的离心管。70%乙醇带走沉淀的盐类并且用挥发性的乙醇
代替异丙醇，使 DNA 更加容易的在溶解。
15、风干沉淀 5-10 分钟，然后再用一个适当体积的 buffer（例如：TE，PH8.0，或 10mM
Tris-Cl，PH8.5）溶解 DNA。
上下吹吸 DNA 来促进溶解会导致断链并且应该避免。过度干燥的颗粒将会使 DNA 很难再溶解。DNA 的溶解
在弱碱性的条件下进行；它很难在酸性缓冲液中溶解。
