各种复杂的食品、果实中提取总DNA

（适合从各种复杂的食品、果实以及难以提取的一切样品中提取总 DNA）

广州健仑生物科技有限公司

试剂盒组成

储存条件

本试剂盒在室温（15-25 ℃）下可保存一年。

产品特点：

TM Food Total DNA Extraction kit 采用独特的疏水膜技术，彻底去各种复杂样品中的干扰物，提取高纯度的 DNA，采用优化的缓冲系统， 可从多种不同类型的复杂的食品以及难以提取的动植物和植物器官等一切样品中提取总 DNA。 Karroten 食品总 DNA 提取试剂盒产品应保存于室温15~25℃ （不需要保存在 4℃或更低温度）。该产品可保证在购买之日起至少一年內有效

注意事项：

1.实验前准备工作：详细阅读该手册熟悉各步骤，并准备好所有的试剂盒组分、研钵、研棒、药匙、1.5 ml 和 2 ml 灭菌离心管以及 37 ℃和 65 ℃ 的温浴条件。

2.KSL1, KBL1 和 KW1 在低温时可能产生混浊或沉淀，在 37-65 ℃温浴片刻即可。

3.Buffer KW 第一次使用前请按瓶上标签加入 50 ml 无水或 95%乙醇。每次使用后，请立即拧紧盖子。

4.对于非常贫瘠的样品，可以增大样品的量。

5.对于含水分较多的样品，建议先高速离心，去除一部分水，然后再操作。有机体会沉淀，不影响实验结果；如果不离心，样品体积不宜超过300 μl, 否则影响裂解效率。

操作步骤：

（一）平衡吸附柱

1.取一TM Mini Column 柱装在一个 2 ml 收集管上（已备）。加入 300 μl Buffer KB 平衡液至柱子内，室温 13 000 rpm 离心 1 min，使平衡液完全流过柱子。弃收集管中的滤液，将空柱套回收集管内。

注意：柱子不平衡，将导致 DNA 产率减少。

(二) 样品处理

2.可根据不同条件选择以下方法：

A：研磨法：

1)液氮研磨: 取 10 - 300 mg 食品样品于研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待样品磨碎，再加少量液氮，再研磨，如此三次。将样品迅速转入 2 ml 离心管，加入 600-1000 μl Buffer KSL1，65℃水浴 15 min，其间混匀 2-3 次。然后 13,000 rpm,常温离心，5 min.

注意：样品的量以及 KSL1 的量取决于食品样品的类型以及 DNA 量。一般来说，加入 KSL1 后能去取出 500μl 的上清为合适。

2)小心将上清液转至干净的 2ml 离心管，加入 1.0-1.5 倍体积的异丙醇， 混匀，13,000 rpm, 3 min, 离心弃去上清; 保留沉淀。在沉淀中加入 100μl KE, 彻底溶解,然后加入 1000-1500 μl KBL1，13,000 rpm, 2 min，上清液待转移。

Ｂ.微波加热法

1)取 10 - 300 mg 食品样品样品于 2 ml 离心管中，加入 600-1000 μl Buffer KSL1，强烈混匀，尽量不保留大的颗粒。65℃水浴 15 min，其间混匀 2-3 次。然后 13,000 rpm,常温离心，5 min.  上清和沉淀都要备用。

2)上清液转入新的 2 ml 离心管，待用。

3)将带有沉淀的离心管放入普通微波炉，*功率下，加热 1min；待结束后再加热另一个 1 min；然后第三个 1 min.

4)加入 600-1000 μl Buffer KSL1 于加热的离心管内，强烈混匀，65℃ 水浴 15 min，其间混匀 2-3 次。然后 13,000 rpm,常温离心，5 min. 上清备用。

5)上清转移至另一新的 2 ml 离心管。

6)在2) 和5) 的上清液中分别加入1.0-1.5 倍体积的异丙醇，混匀1 min, 常温离心 13,000 rpm, 3 min, 去上清; 保留沉淀。在沉淀中分别加入 100 μl KE 溶解。合并两个离心管的溶液。

7)加入 1000-1500 μl KBL1，混匀，一般不会出现沉淀。 如有沉淀， 离心弃去。

（二）吸附

3.将混合液转移到平衡过的吸附柱内，室温 13 000 rpm 离心 30 s，使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中的过滤液，将吸附柱套回收集管中。注意：1）室温太低可能造成 KBL1 混浊或沉淀，在 37 ℃温浴片刻即可。

2）如上清液体积过大，可以分成数次上柱，每次不要超过 700 μl。

4.（可选）加入 30 μl  浓度为 20-50 μg/ml 的RNase A  于柱的膜上，37 ℃放置 5-10 min。

注意：本试剂盒没有配备 RNase A 溶液。一般来说，这一步没有必要，因为本试剂盒的纯化柱对 RNA 没有吸附能力。如果实验要求不能残留微量RNA，可采用这一步处理。

(三) 漂洗

5.加入 700 μl Buffer KW1，室温 13 000 rpm 离心 30 s，弃去收集管中的过滤液，保留柱。

6.加入 700 μl Buffer KW，室温 13 000 rpm 离心 30 s，弃去收集管中的过滤液，保留柱。注意：Buffer KW 在*使用之前必须加入 50 ml 无水乙醇，并置于室温下保存。

7.（可选）重复用 700 μl 70%乙醇（室温）洗涤柱子，室温 13 000 rpm

离心 1 min。（注意：用 70%乙醇漂洗有利于提高 DNA 纯度）

8.弃去收集管中的滤液，将空柱套回收集管内。室温下，13 000 rpm 离心 2 min 以甩干柱子基质残余的液体。

注意：此步骤不可省，否则将导致乙醇残留于 DNA 中，影响后续反应。(四)洗脱

9.把柱子装在一个新的 1.5 ml 离心管上，加入 50 μl 的 KE（可用灭菌的 TE 10 mM Tris-HCl，pH 8.0 或纯水代替，纯水可预先用 NaOH 调 pH 值至 8.0），65 ℃放置 5-10 min，13 000 rpm 离心 1 min 以洗脱 DNA。（也可以将 KE 预热至 65℃，再加至膜上，可以减少放置时间至 1min）

注意：小心加 KE 到柱中吸附膜的中间部位，并确保液体将膜全部覆盖。

10.DNA 应保存于 4 ℃，若长时间保存，可冻存于-20 ℃。

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